1 、 根系分泌物的提取分离 采用两种不同的试剂进行浸提，通过 GC-MS 进行物质鉴定，得出适宜马尾松根 系分泌物的提取方法。 方法一： 分别取马尾松、 枫香根际土壤于有盖玻璃瓶中， 按 1 ： 3 的比例加入 85% 的 乙醇 ，至于 20 ℃磁力搅拌器， 2600rpm 浸提 24h 。再置于 20 ℃高速离心仪中， 3500rpm 旋转 15min 。离心后上清液，置于旋转蒸发仪脱去浸提剂，用乙酸乙酯 （ 1 ： 1 ）萃取 2 次， 乙酸乙酯 相为中性组分；再用 1mol/L 的 HCl 将水相的 pH 值调至 3.0 后，再用等量的乙酸乙酯萃取 2 次，乙酸乙酯相为酸性组分；再用 1mol/L 的 NaOH 将水相 pH 值调至 8.0 ，再用等量的乙酸乙酯萃取 2 次，乙酸乙 酯相为碱性组分。合并酸、中、碱性乙酸乙酯相，即为马尾松、枫香根系分泌物 提取液。 方法二：分别取马尾松、枫香根际土壤置于有盖玻璃瓶中，按 1 ： 3 的比例加入 20% 乙酸乙酯，置于 20 ℃磁力搅拌器中， 2600rpm 浸提 24h 。再置蒸筛于 20 ℃高速离 心仪中， 3500rpm 旋转 15min 。离心后的上清液，即为马尾松、枫香根系分泌物 提取液。 2 、根系分泌的鉴定 将上述两种浸提方式得到的马尾松、 枫香根系分泌物提取液， 35 ℃真空旋转蒸发 仪浓缩至 1ml ，无水筛坊硫酸钠脱水后，供 GC-MS 测试分析。 检测仪器为 GC-MS Agilent-6890N/59731 （美国安捷仑公司） ， 色谱条件：色谱柱（ Agilent 122-3832 ） ： 30m× 0.25mm× 0.25um ， DB-35ms ； 进样口温度 250 ℃； 程序升温： 柱温 70 ℃ （ 2min ） ， 以 10 ℃﹒ min-1 升温至 280 ℃， 20min ；载气： He ；流速： 1.0ml ﹒ min-1 。 质谱条件： EI 源（电子轰击源） ；轰击电压： 70eV ；离子源温度： 230 ℃；扫描 范围 m/z ： 35-500amu ；扫描速度 0.2s 扫全程；检测器电压 500V ；电流 350uA ； 四级杆温度： 150 ℃； 溶剂延迟时间 3.0min ； 进样量： 1.0uL ； 不分流进样。 GC-MS 数据应用标准质谱谱库 NIST02 获得，采用面积归一化法计算各类物质的相对含 量。 方法三：烤烟根系分泌物的研究 高欣欣 1 、具体方法为：取定量过滤后的收集液用乙酸乙酯萃取，得到 乙酸乙酯相为中性组分；将剩余水相用 1M HCl 调节 pH 至 2 后， 再用乙酸乙酯萃取， 得到乙酸乙酯相为酸性组分； 将剩余水相再 用 1M NaOH 调节 pH 为 8 ， 用乙： 酯萃取， 得到乙酸乙酯相为 碱性组分， 将酸性、 碱性和中性乙酸乙酯萃取液分别减压浓缩至 1ml （ 45 ℃） ，过 0.45 μ m 滤膜。 2 、根系分泌物的硅烷化处理 利用常文理于 1990 年提出的方法， 将乙酸乙酯萃取后的上述浓 缩样品中分别加入 0.25mL 硅烷化试剂 （ BSTFA:TMC=5:1 ） ， 加盖 密封后于 80 ℃水浴中衍生 2 h ，待测。 原因是什么？？？？ 3 、 GC-MS 分析条件 经硅烷化处理后的各组分根系分泌物采用 Agilent7890A-5975C 进行仪器分析测定。毛细管柱采用 HP-5MS 柱（ 30m × 0.25mm × 0.25 μ m ） ，进样口温度为 250 ℃，升温程序为 50 ℃（ 2min ） ，以 6 ℃ /min 程序升温至 250 ℃（保持 15min ） 。载气为 He ，流量 1ml/min ，进样量为 1 μ l ，离子源温度 230 ℃，轰击电压 70eV 。 应用 NIST98 质谱数据库，分析质谱图，确定物质组成。 方法四：刺槐根系分泌物的研究 石鑫 第一种 提取办法是参考了尹玉莲等人对橡胶树以及王晗光等人对巨桉根系分泌 物测定时的超声浸提法。此办法操作较为简单 , 只需要将过筛后的土壤放入具塞 锥形瓶中 , 加入 正己垸 到完全淹没土样 , 再超声浸提 20-30min, 过 0.45um 微孔 滤膜 , 将过滤的溶液在 35 ℃条件下旋转浓缩至浅敢径 2mL, 即得到根系分泌物的待测液 ( 尹玉莲等 ,2008; 王晗光等 ,2009) 。 第二种 是三性萃取法 , 该方法参考了张汝民等对梭梭的根系分泌物提取的经验。 首先取根系土 lOOg 于容量瓶中 , 加入蒸馏水 50ml, 置于 20 ℃摇床中 ,lOOrpm 消 化 24 h 。再将容量瓶放于 20 ℃高速离心仪中 ,3500rpm 旋转 15min 。将离心后上 清液用乙酸乙酷萃取 2 次 , 得中性成分 ; 再将上清液用 Imol/L 的 HC1 调 PH 至 4, 萃取 , 得酸性组分 ; 用 Imol/L 的 NaOH 将上清液的 PH 值调至 9, 萃取得碱性组分。 合并乙酸乙酯相 , 在 35 ° C 旋转蒸发仪中浓缩至 0.5ml, 即得到根系分泌物待测液 ( 张汝民等 ,2007) 。 方法三 是邵东华、 宁心哲、 樊石磊等对油松、 虎榛子根系分泌物实验时萃取硅烷 化法的改进。首先称取 lOg 土样放入烧杯 , 用 50 mllmol/L 的 NaOH 溶液淋洗植 株根系 , 收集洗液 , 倒入盛有 lOg 土的烧杯中 ; 放到 20 ℃摇床上 ,180rmin 消化 lOh; 过滤 2-3 次 , 取 20mL 滤液 , 调节 pH 值到 2.5-3, 滴入饱和 NaCl, 用乙醚萃取 3 次 , 合并醚相 , 转入心型瓶中 , 旋转浓缩至干 ; 滴入甲醇 , 溶解瓶壁上物质 , 并移入直径 为 1.8- 2.0mm 毛细管 , 抽干 ; 加入 8ul 硅院化试剂 ,lOO'C 衍生 Ih 后便为待测液 ( 邵 东华等 ,2011) 使用的第四种方法 是陈华君、 金幼菊等人在对杨树等根系分泌物测定时的萃取甲 酯化提取方法。 首先取 200g 跟际土 , 加入适量 70% 的乙醇 , 超声 10min, 此步骤重 复 3 次。抽滤、减压浓缩、离心。将上清液 40ml 用 2 mol/L 的 HC1 调 pH 至 2-3, 用 O.lmol/L 乙酸饱和的乙酸乙酯萃取 3 次 , 将有机相合并 , 在 4(rC 条件下解压浓 缩至干 ,CH2N2 甲酯化后 , 即为酸性物待测液。再取上淸液 40m 用 0.1 mol/L 磷缓 液缓液调 pH ≥ 8, 用 O.lmol/L 怜缓饱和的正丁醇萃取 3 次 , 将有机相合并 , 在 55 ° C 条件下解压浓缩至干，用硅烷化试剂进行 TMS 衍生化 , 即为碱性物待测液 ( 陈华君等 ,1997)