2.片段和载体酶且要完全，确定大小没问题不过有些载体本身就很很难连接！建议在连接时，先加入载体和目的基因，85度热浴15min,除去残留的酶和未纯化干净的杂蛋白。 然后再加入酶和BUFFER。适当延长连接时间24小时以内都没问题的！如果还是不行，。