皮肤质量、肤质基因检测导读：

光化性角化病 (AKs) 是表皮角质形成细胞发育不良的病变，是安铜浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 的前兆，其英文疾病名称为Actinic Keratosis。佳学基因致力于通过基因解码确定在从正常皮肤到光化性角化病皮肤再到侵袭性浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 皮肤过程的致病基因。这一工作具有一定的挑战性，因为在这一进展的所有阶段都存在大量 UVR 诱导的突变。在基因解码过程中，佳学基因收录了迄今为止最大的光化性角化病(AK)全外显子组测序研究，并对这些病变进行了突变特征和候选驱动基因分析。在来自免疫抑制和免疫功能正常患者的 37 个光化性角化病(AK)中证明，AK 和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 在突变负荷、拷贝数改变、突变特征和驱动基因突变模式方面存在显着相似性。光化性角化病的基因解码确定了 44 个显着突变的光化性角化病(AK)驱动基因，并确认这些基因在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中也发生了类似的宰葵改变。在所有的患者发现了硫唑嘌呤突变特征，为它在角质形成细胞癌变中的作用提供了进一步的证据。cSCC 与光化性角化病(AK)的不同之处在于具有更高水平的样本内异质性。信号通路的改变也不同，免疫相关信号和 TGFβ 信号在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中的突变明显更多。将致病基因鉴定基因解码的发现与独立的基因表达数据集相结合，证实失调的 TGFβ 信号可能代表 AK-cSCC 进展中的一个重要事件。进一步证明其在角质形成细胞癌变中的作用。

光化性角化病基因检测导读：

光化性角化病 (AKs) 是由慢性 UVR 暴露引起的表皮角质形成细胞发育不良病变。人们普遍认为光化性角化病(AK)是皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 癌前病变：至少三分之二的浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 由光化性角化病(AK)引起，尽管每年只有不到 0.6% 的光化性角化病(AK)会进展为 cSCC。

识别驱动 AK-cSCC 进展的基因组改变具有挑战性，因为与紫外线照射相关的角质形成细胞中存在高水平的背景突变。cSCC 的平均肿瘤突变负荷 (TMB) 为每兆碱基 DNA 50 个突变，使其成为所有人类癌症中突变最多的癌症之一。表观基因组改变和免疫因素的参与进一步增加了对这一进展进行基因解码的复杂性。

一些分子遗传学研究已经在基因表达、染色体不稳定性和已知癌症基因突变的水平上检查了光化性角化病(AK)和 cSCC。这些基因解码过程通常表明光化性角化病(AK)和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 具有相似的遗传改变，但在光化性角化病(AK)或多或少的基因组不稳定方面存在一些冲突。然而，大多数 AK-cSCC 遗传学研究都是在固定组织上使用靶向技术，这有很多局限性和偏见。之前只有三项研究使用全外显子组测序（WES）来研究 AK；这些研究样本量 ≤10 个样本，并报告了光化性角化病(AK)和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中相似的突变谱，已知浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 肿瘤抑制基因TP53、NOTCH1 、NOTCH2和FAT1中的频繁突变。

光化性角化病基因解码方法介绍

收集患者样本和临床数据

在获得书面知情同意后，从参与者那里获得临床诊断和组织学证实的光化性角化病(AK)的 4 毫米钻孔活检。AK 和静脉血的处理以匹配种系 DNA 和临床数据收集。该研究需得到伦理委员会的批准，并根据赫尔辛基原则宣言进行。

DNA提取和遗传分析

按照佳学基因基因解码标准程序进行 DNA 提取、高通量测序和遗传分析。

WES 数据处理、体细胞变异识别、注释和可视化印筛洞

使用佳学基因基因解码分析流程 WES 数据进行分析和注释。Maftools 用于总结、可视化和比较光化性角化病(AK)和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 突变注释格式文件，并制作基因突变分布的棒棒糖图。基于非负矩阵分解方法，使用癌症突变特征中的体细胞突变目录，确定了跨外显子组的突变特征。

使用 WES 数据识别 CNA 和 LOH

来自 WES 数据的 CNA 和 LOH 事件分析基于先前描述的组合方法。确定了每个样本中复制增益、复制丢失和复制中性 LOH 所针对的基因。CNA 调用的阈值按质量控制标准进行。

肿瘤亚群鉴定和克隆性分析

扩展嵌套亚群的倍性和等位基因频率用于估计每个克隆和亚克隆群体的克隆扩增和细胞频率。还根据显性克隆的细胞频率估计肿瘤纯度。所有体细胞变异都分配给它们的嵌套克隆。

基因表达数据分析与整合

选择了五组患者样本的表达数据并从 Gene Expression Omnibus 下载：GSE45216、GSE42677、GSE84293、GSE2503和GSE32628（Hameetman 等人，2013 年）。使用limma R包进行不同组间的差异表达分析。差异表达基因定义为调整后的P  ≤ 0.1。

光化性角化病基因解码结果：基因检测的科学依据

患者和样本

总共包括来自 37 名患者（中位年龄 = 70 岁，范围 = 48-86 岁）的 37 个 AK：IS 患者的 23 个光化性角化病(AK)和 IC 患者的 14 个 AK。来自先前分析的 16 名这些患者的浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 样本的 WES 数据也可用于比较。

突变负担和突变特征

WES 靶向 20,965 个基因的 334,378 个外显子，平均覆盖率为 ×53，其中 83% 的目标碱基被 ×20 覆盖，94% 的目标碱基被 ×10 覆盖。总共鉴定出 80,511 个体细胞突变（范围 = 12–8,326 个/AK）。其中，49,853 个是非同义突变（每个光化性角化病(AK)的范围 = 9–4,993），中位数为 1,676 个，每个光化性角化病(AK)有 1,071 个非同义突变（图1a 和补充表 S4和S5）。这对应于每兆碱基 DNA 43.5 个突变的平均 TMB，类似于我们之前在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中报告的每兆碱基 DNA 50 个突变的 TMB。

比较总的非同义突变时，来自 IS 患者的光化性角化病(AK)突变明显多于来自 IC 患者的突变（中位数分别为 1,609 和 729 突变；Wilcoxon 检验，P  = 0.03). 当控制每个样本读取深度时，结果仍然显着。来自 IS 患者的光化性角化病(AK)的突变负担(TMB)中值显着高于 IC 患者（每兆碱基 DNA 分别有 55.9 和 22.3 个突变；Wilcoxon 检验，P = 0.03）。与浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 相比，AK 的非同义突变率没有显着差异（中位数 = 1,070 对 912；Wilcoxon 检验，P = 0.32）。

确定了九个单碱基替换突变特征。共有 33 个 AK（89%）显示出特征性的 UVR 特征（7a/b，13-97%），主要是双嘧啶位点的 C > T 跃迁。共有 20 个光化性角化病(AK)(54%) 具有不同水平 (5-100%) 的特征 5 突变，35 个光化性角化病(AK)(95%) 具有低水平的特征 1 突变 (1-13%)。特征 5 和 1 的病因尚不清楚，但在大多数癌症中都以低水平常见，并且是时钟样的，因为突变的数量与年龄相关。

仅在暴露于硫唑嘌呤的22 个 AK患者中（59%）中检测到特征 32（Fisher 精确检验，P < 0.00001），这重复了在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中的发现。与浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 相比，患病率与硫唑嘌呤暴露的持续时间没有显着相关性（r  = 0.21，P  = 0.33）。

体细胞拷贝数畸变

还检查了拷贝数畸变 (CNA) 和杂合性丢失 (LOH) 事件。在光化性角化病(AK)队列中，每个光化性角化病(AK)基因组的中位数为 9%（范围 = 0–62%）受到 CNA 的影响，类似于 cSCC（Wilcoxon 检验，P  = 0.68）并且独立于免疫状态（Wilcoxon测试，P = 0.26）。突变负荷与受 CNA 影响的基因组比例之间没有显着相关性（r = 0.25，P = 0.13）。

染色体区域 9p (43%)、13q (32%)、3p (24%) 和 5q (24%) 的丢失是最常见的拷贝数丢失；3q (19%)、8q (19%)、5p (16%)、20 号染色体 (16%) 和 1q (14%) 的增益是最常见的增益。最常见的光化性角化病(AK)CNA 与浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 显着相关（r  = 0.68，P  = 0.003）。

GISTIC分析确定了 19 个显着缺失的区域 ( q < 0.25)，包含 859 个基因，包括 27 个已知的癌症基因。9p21.3 是光化性角化病(AK)中最显着缺失的片段，包含 10 个癌基因，包括CDKN2A、JAK2和MLLT3。九个区域显着增加 ( q < 0.25)，包括 59 个基因，没有一个已知与癌症相关。IC 和 IS 子组的分析没有解决任何主要差异，因为每个组内的功率有限。

AK中显着突变的基因

基因解码使用三种方法来识别显着突变基因 (SMG)：MutsigCV ( P< 0.01) 、OncodriveFM ( q < 0.05)  和 OncodriveCLUST ( q < 0.05)。通过至少两种方法确认了总共 44 支 SMG并包括在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中一致报告为突变的抑癌基因（TP53、NOTCH1、NOTCH2、FAT1 和KMT2C ）。HMCN1在 50% 的光化性角化病(AK)和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中也发生了改变，这与之前的小型研究一致。其他显著突变基因（SMG)包括CHEK2、PBRM1、PTPRB、EBF1、STRN和PAX3。所有这些都与其他癌症有因果关系。PIK3CA是唯一使用所有三种方法显着突变的致癌基因：非同义突变存在于 12 个光化性角化病(AK)(32%) 中，其中几个针对 N 末端部分，包括 PI3K_p85B 结构域中的一个无义突变和三个错义突变以及一个热点剪接突变（n = 3）就在这个域的下游（图 3d). 五种光化性角化病(AK)突变（包括剪接位点热点）是已知的功能获得性致癌突变。

其他 SMG（IGF1R、ATAD2、ABI3BP、MSR1、ADAMTS9、ADAM19、KIF13B、DAB2、EIF4G3、GPR161、USP34、KCNK5、ACSS1、TGFBRAP1、RAB22A、XAB2、PEG10、IMPA1）都与其他癌症相关：除RAB22A外，其中的一些在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 癌症数据库中的体细胞突变目录中有报道（https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic）。其余 12 个 SMG（HEATR5B、KIF24、ANKRD17、AACS、MYEF2、GXYLT1、CCDC71、EPB41L2、GPS1、SLC44A3、INSIG2和RPUSD2) 在其他癌症中没有已知的作用，但在癌症数据库中的体细胞突变目录中发现在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中发生了突变。SMG 中的突变频率与免疫状态无关，这表明两组中的光化性角化病(AK)具有共同的驱动因素。44 个显著突变基因（SMG)中存在的大多数突变特征是特征 32 (40%) 和特征 7 (38%)，暗示硫唑嘌呤和紫外线照射是主要的环境致癌物。

使用佳学基因的显著突变基因（SMG)分析流程进行的 IS 和 IC 子组分析在 IS 组和 IC 组中确定了 23 个 SMG（由 OncodriveFM 和 MutsigCV 检测，由于样本量较小，实施了P < 0.05 截止值）和 IC 组中的 10 个 SMG. OncodriveCLUST 对此分析不成功。TP53、NOTCH1和NOTCH2是 IS、IC 和联合队列中唯一共有的 SMG。

AK 和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) SMG的比较

佳学基因整合了体细胞突变和 CNA，为 44 个AK显著突变基因（SMG)产生突变 OncoPrint并将其与之前系列中 22 个浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC)显著突变基因（SMG)的 OncoPrint 进行比较。TP53、NOTCH1和NOTCH2是唯一共享的 SMG，总共 63 个显著突变基因（SMG)中有 6 个在光化性角化病(AK)和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 之间显示出不同的频率。CCDC71L（卡方检验，P  = 0.004）和STRN（P  = 0.014）在光化性角化病(AK)中以较高频率改变，而LCLAT1（P  = 0.032）、HERC6（P  = 0.029）、MAP3K9（P  = 0.043）和TMEM51 ( P = 0.048) 在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中以更高的频率改变。当针对多重比较进行调整时，63 个显著突变基因（SMG)中没有一个在光化性角化病(AK)和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 之间发生显着变化。

光化性角化病还将光化性角化病(AK)SMG 与高分化和中等和/或低分化群体特异性显著突变基因（SMG)进行了比较。AK 中的显著突变基因（SMG)与分化良好的浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中的显著突变基因（SMG)之间没有显着差异，但 10 个中度和/或低分化的浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC)显著突变基因（SMG)在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中的改变明显大于 AK（PRB1、TMEM51、LRP1、POLH、ACVR2A、RPLP1、ZZEF1 、VWF、ICAM1和HECTD4）。AK 和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC)显著突变基因（SMG)沿蛋白质结构域的突变分布相似，如前所述，AK 中的PIK3CA热点除外。

先前与浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 相关的基因，如CDKN2A和HRAS，被发现在光化性角化病(AK)和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 队列之间以相似的速率发生了改变（CDKN2A分别改变了 54.1% 和 45%， HRAS分别改变了 16.2% 和 22.5% ）。

接下来，皮肤病基因解码基因检测比较了 63 个显著突变基因（SMG)中光化性角化病(AK)和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 之间非同义突变的癌细胞部分，以评估它们的克隆性，并使用同义和非翻译区域突变作为阴性对照来确定任何基因的突变是否在光化性角化病(AK)或浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中更具克隆优势。两个基因（CACNA1C和KCNK5）显示出重要证据表明，它们中的非同义突变在光化性角化病(AK)中比在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中更具克隆优势，表明这些基因可能在光化性角化病(AK)谱系中受到直接选择。

克隆进化的推断和遗传变化的顺序

为了评估样本内异质性水平，皮肤病的基因解码使用嵌套亚群的扩展倍性和等位基因频率进行克隆性分析，估计每个样本中克隆的数量及其比例。共有 31 个光化性角化病(AK)(84%) 具有足够数量的体细胞突变 (≥200) 用于分析。确定了样本内异质性的变化，每个光化性角化病(AK)的中位数为四个（范围 = 1-9）克隆（Wilcoxon 检验，P < 0.01)。

对于 44 个显著突变基因（SMG)中的每一个，光化性角化病的基因解码基因检测评估了从发现它们是克隆或亚克隆的聚合频率推断的突变获取顺序。22 个 SMG（TP53、NOTCH1、FAT1、ADAMTS9、CCDC71、RB1、PBRM1、ADAM19、CHEK2、KIF13B、DAB2、ABI3BP、GPR161、XAB2、GPS1、IMPA1、USP34、GXYLT1、EPB41L2、PAX3、 KCNK5和INSIG2)是克隆的，表明这些基因的改变更有可能是光化性角化病(AK)发育的早期事件。与前面提到的 22 个显著突变基因（SMG)相比，在其余 22 个显著突变基因（SMG)中发现了相对较大比例的亚克隆非同义突变，这意味着较晚的发展，尽管其中大多数仍然观察到克隆突变多于亚克隆突变，除了PIK3CA，RAB22A和KIF24 。对于光化性角化病(AK)和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 共享的三个 SMG，克隆模式相似，在TP53和NOTCH1中观察到的克隆突变比例高于在NOTCH2中观察到的克隆突变。

七个光化性角化病(AK)在TP53中有一个以上的非同义突变，致病性基因解码估计了这些病变中多个突变的时间。在四个样本（AK05、AK33、AK34 和 AK35）中，所有TP53突变似乎都是克隆性的，因此根据克隆性分析可能是早期事件。两个样本（AK04 和 AK32）显示了早期和晚期（即亚克隆）事件的混合，一个样本（AK38）表现出两种 TP53突变作为晚期事件。这些数据表明，虽然TP53突变通常作为早期事件观察到，但在光化性角化病(AK)的发展后期可能会发生其他突变。

患者内光化性角化病(AK)与浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 的比较

共有 16 个光化性角化病(AK)(43%) 也有来自同一个体的浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) WES（主要来自解剖学上不同的日光照射区域）。在数据可用的 AK-cSCC 对中，有 71.4%（14 个中的 10 个）的突变特征谱呈显着正相关。七对 AK-cSCC 具有重叠的 CNA 片段，涉及总 CNA 片段的中位数为 20%，最常见于 3 号、9 号和 17 号染色体。CNA 的方向在很大程度上是一致的，尽管没有统计学意义（卡方检验，P = 0.06)。

突变基因的信号通路分析

基因解码比较了光化性角化病(AK)和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 之间的显着突变的信号传导通路。许多免疫系统信号通路在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中的突变明显多于 AK（TCR、Fc epsilon-RI、RIG-I 样受体和趋化因子信号）。TGFβ、脂肪细胞因子、GnRH 和胰岛素信号在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中的突变也明显更多。几种代谢途径发生了差异突变：乙醚脂质、丙酮酸或 α-亚麻酸等在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中发生的突变明显更多。

基因组驱动基因、CNA 和基因表达谱的数据整合分析

基因解码整合了正常皮肤、AK 和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 的现有基因表达谱，以通过光化性角化病(AK)SMG 在疾病进展中的表达模式来研究光化性角化病(AK)SMG 的潜在肿瘤抑制或促进作用。皮肤病基因解码使用了五个独立的数据集。数据集中的显著突变基因（SMG)层次结构与观察到的两个主要集群大致一致：一个由在正常皮肤中上调并在光化性角化病(AK)和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中逐渐下调的显著突变基因（SMG)组成，另一个集群显示出相反的模式。

在光化性角化病(AK)与正常皮肤中，至少有两个数据集（ KIF24、KCNK5、EPB41L、INSIG2和ABI3BP）中有 5 个显著突变基因（SMG)显着下调，表明其具有抑癌作用。NOTCH1是唯一显着上调的 SMG。在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 与光化性角化病(AK)中，IMPA1是唯一在至少两个数据集中显着差异表达的 SMG，在浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中上调，表明肿瘤启动子作用。

由于浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 中 TGFβ 信号通路的突变明显多于 AK，基因解码分析了正常皮肤、AK 皮肤和浸润性皮肤鳞状细胞癌 (cSCC) 皮肤中 TGFβ 通路基因的表达模式。数据集显示了两组依赖于进展的 TGFβ 信号失调。一个簇显示正常皮肤中的基因上调，这些基因的下调越来越多，从光化性角化病(AK)进展到 cSCC，第二个簇具有相反的模式。

皮肤癌发生与恶化的基因解码评估了通过GISTIC 分析确定的显着删除和获得区域的基因表达，该分析揭示了删除区域中的 55 个基因被下调（在至少两个数据集中）和获得区域中的两个基因被上调（至少在两个数据集中）数据集）在光化性角化病(AK)与正常控制。